升降二丹抗肿瘤作用的研究

来源：移毒疗法

 升降二丹抗肿瘤作用的研究

注，本文原载于《河南大学学报》2014年5月第33卷第2期,作者李红、杜钢军等。

摘要：

目的：研究升降二丹对小鼠体表肿瘤的治疗作用。

方法：建立小鼠肝癌H22 、肺癌lewis皮下移植肿瘤模型和小鼠乳腺癌模型 ，通过小鼠存活期 、肿瘤体积 、肿瘤抑制率 、脏器指数等考察升降二丹对小鼠体表肿瘤生长的影响；用MTT法观察升降二丹对lewis肿瘤细胞增殖的影响 ；ELISA法检测瘤组织TNF‐α及CEA含量 ，初步探讨升降二丹的抗肿瘤机制 。

结果：升降二丹能使小鼠体表肿瘤逐渐缩小 ，延长荷瘤小鼠生存时间 ，阻止小鼠肿瘤自发转移 ，增加肿瘤组织TNF‐α ，减少肿瘤组织CEA ；体外实验 ，升降二丹可抑制肿瘤细胞的增长 。 

结论：升降二丹有明显的抗体表肿瘤作用 ，其机制可能与增加肿瘤组织TNF‐α含量和减少肿瘤组织CEA含量有关。 

中药在改善肿瘤患者的体质、降低化疗药物的毒性、增强化疗药物的疗效方面独具特色 。升降二丹是中医外科常用来提脓、祛腐的主药 ，首载于明代陈实功的《外科正宗》。升降二丹是外科圣药 ，具有搜脓、拔毒、祛腐、生肌的功效。现代医学认为 ，红升丹除了传统的提脓、祛腐作用外。还具有消肿 、散结功能。在中医学术史上 ，癌瘤曾经作为痈疽的一种 ，一般都是借鉴痈疽的治疗方法 。当代中医也有人认为，癌瘤即为癌毒 ，可参考疡科古法诊治 。 目前，国内外升降二丹抗肿瘤活性的研究报道相对较少 。传统中药用药经验认为 ，白降丹多用于提毒排脓 ，红升丹多用于化腐生肌。我们认为 ，升降二丹可取长补短 ，既能将瘤毒引至体表 ，又能将之消散于无形。本文用小鼠肝癌H22 、肺癌Lewis皮下移植模型和小鼠乳腺癌模型观察了升降二丹对小鼠体表肿瘤的治疗作用 。 

1.材料

 1.1 药品与试剂 

红升丹、白降丹 ：湖北省汉川北桥银珠厂产品 。 

动物实验 ：外用 ，取原生药材红升丹、白降丹各1g ，凡士林20g ，混合均匀制成涂抹药膏 ，备用 ；内 服 ，取原生药材红升丹、白降丹各１g ，体积分数0.5％ CMC‐Na溶液（本实验室自己配制）40mL ，混成均匀 溶液。 

细胞实验 ：取原生药材红升丹、白降丹各1g ，用 PEG400 10mL溶解 ，无菌滤器过滤 ，滤液无菌密封 备用。TNF‐α和CEAELISA试剂盒（深圳晶美公司提 供 ，进口分装） ；DMEM 培养液（本实验室配制） ；胎牛血清、PBS（本实验室配制） ；胰酶、Tris‐氯化铵裂解 液、MTT、体积分数为０ ． ５％ CMC‐Na溶液（本实验室 配制） ；DMSO（本实验室配制） ；生理盐水（本实验室 配制）。 

1.2 动物和细胞株 

昆明种小鼠 ，雌性 ，体质量 20±2g ，河南省医学实验动物中心提供（合格证号 ：豫动合字 101号） ；C57BL／６ ，雌性 ，体质量20±2g ，北京维通利华实验动物有限公司提供 ；H22肝癌 ，本实验室昆明鼠腹水传代保存 ；lewis肺癌和 ４T１ 乳腺癌细胞株 ，中国科学院上海细胞库提供 ，本实验室保存。 

1.3 仪器 

HDL洁净台（北京东联哈尔仪器制造有限公 司） ；快速混匀器 SK‐１（常州国华电器有限公司） ；ElX800酶标仪（美国 BIO‐IEK 公司） ；TDL‐508 台式离心机（上海安亭科学仪器厂） ；YN‐ZD‐２ 电热蒸馏水器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂） ；LDZX７５KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂） ；CHA‐S恒温振荡器 （常州国华电器有限公司） ；BD‐４００ 冰柜（河南冷柜厂） ；电子天平 FA１００４N（上 海精密仪器有限公司）。

2.方法

2.1  升降二丹对昆明小鼠肝癌 H22移植性肿瘤生长的影响

无菌条件下 ，取昆明小鼠体内传代的 H22肿瘤细 胞 ，加无菌生理盐水1:7稀释。于小鼠右后肢背部接种0.2mL／只。次日将荷瘤小鼠随机分为模型组(体积分数0.5％ CMC‐Na溶液0.2mL／10g）和给药组（升降二丹１g／kg）。灌胃给药 ，每日２次。待肿瘤长出 ，隔天称量小鼠体质量 ，每隔一天用游标卡尺测肿瘤长径、短径１次。约３周后处死小鼠 ，剥离肿瘤 、 肝脏、脾脏和胸腺 ，并称重。计算肿瘤抑制率及肝脏 、 胸腺、脾脏指数。

肿瘤体积（cm３ )=肿瘤长度× 肿瘤宽度 × 肿瘤宽度／２ ；抑瘤率（％ ）＝ （正常对照组瘤质量均值 －用药组瘤质量均值）／正常对照组瘤质量均值 × 100％ ；脏器指数％ ＝ 脏器质量均值（mg）／处死当日体质量均值(g)×100％ 。

抑瘤率＞ ３０％ ，P ＜0.05，为抗肿瘤有意义。 

2.2  升降二丹对C57BL/6 小鼠Lewis肺癌自发肺 转移的影响

将在体小鼠Lewis肺癌实体瘤组织用组织匀浆器制备单细胞悬液 ，原液按1:7稀释。0.2mL／只接种于20只C57BL/6 小鼠尾静脉 ，建立小鼠Lewis 肺癌自发肺转移模型 。将C57BL／6 小鼠随机分为模 型对照组和升降二丹治疗组。每组10只小鼠。模型组按小鼠体质量给体积分数0.5％ CMC‐Na 溶液0.2mL/10g ，2次／d，升降二丹治疗组按小鼠体质量灌胃升降二丹１g／kg ， ２ 次／d。治疗28d后次日处死小鼠 ，切离肺脏 ，称重。将称重后的肺组织以体积分数10％ 福尔马林（PBS）固定24h，再用生理盐水冲洗 ，计数肉眼可见各组肺癌转移结节总数（个／每片）。

2.3  升降二丹凡士林药膏对昆明小鼠移植性肿瘤生长的影响

在无菌条件下 ，取昆明小鼠体内传代的 H22 肿瘤细胞 ，加无菌生理盐水按 1:7稀释。于小鼠右后肢背部接种0.2mL／只。次日将荷瘤小鼠随机分为模 型对照组（涂抹凡士林膏）和升降二丹组（涂抹红升 丹、白降丹凡士林药膏）。涂抹给药 ,4次／d。待肿瘤长出 ，每隔一天称量小鼠体质量 ,2次／周用游标卡尺 测肿瘤长径 、短径一次 ，观察肿瘤生长的外观变化以 及小鼠生存期 。 

2.4  升降二丹对lewis肺癌细胞生长的影响

［５］ 将 lewis 小鼠肺癌传代细胞用胰酶‐EDTA （2:1）消化液消化（CO２ 培养箱中温育消化）３ min。将消化后的细胞混悬液离心 ５ min ,1000r／min ，取 细胞用含体积分数为10％ 小牛血清的DMEM 完全 培养液洗2遍 ，再用完全培养液调整细胞浓度 ，制成单细胞悬浮液 ，调整细胞浓度 ，点96孔板 ,100μL／ 孔 ,5000个细胞／孔。过夜贴壁。配药物浓度 ，每个浓度４ 个复孔 ，点板加药 ， 100μL／孔。48h后去除96孔板内药液 ，加入MTT ， 4h后加DMSO ，置于酶标 仪570nm测 OD 值。 

肿瘤抑制率＝ （1－给药组 OD 值 ／对照组 OD 值）×100％ 。

2.5  升降二丹对昆明小鼠皮下移植性肝肿瘤组织 TNF‐α及CEA的影响 

取生长良好的荷肝癌昆明小鼠 ，抽取其腹水 ，用 生理盐水稀释8倍 ，用此腹水稀释液给20只雌性昆明小鼠一次性右后肢背部皮下注射（0.2mL／只） ，建立肝癌模型 。待肿瘤长出直径8～10mm时 ，将荷瘤小鼠随机分为模型组和升降二丹组 ，每组10只小鼠。模型组瘤部涂不含药基质凡士林2次／d，升降二丹组瘤部涂含红升丹、白降丹的凡士林膏４次／d，间隔4h。治疗14d后次日处死小鼠 ，剥离肿瘤 ，低温匀浆裂解组织后 ，离心取上清 ，用 ELISA 法检测 TNF‐α 及CEA含量。 

2.6  统计学处理 

定量数据以 珚 x ± s表示 ，实验结果进行 t检验 ，求 P值。P ＜0.05 ，为差异有统计学意义 ；P ＜0.01 ，为非常显著性差异。

3.结果 

3.1 升降二丹对昆明小鼠移植性肿瘤生长的影响 

与模型组相比 ，给药组小鼠的生存期有所延长 ，见图１ ；对H22荷瘤小鼠体质量的影响 ，见图２；对H22荷瘤小鼠皮下肿瘤大小的影响 ，见表１ ；升降二丹对H22荷瘤小鼠肿瘤的生长有抑制作用 ，见图 ３ ；对H22荷瘤小鼠脏器指数有一定的影响 ，其中对脾脏指数影 响最明显 （P ＜0.01） ，见表２。

3.2 升降二丹对C57BL/6 小鼠Lewis肺癌自发肺转移的影响 

与模型组相比 ，升降二丹组能使荷Lweis小鼠体表肿瘤逐渐缩小 ，延长荷瘤小鼠生存时间 ，阻止小鼠肿瘤自发转移 ，见图４、图５。

3.3  升降二丹对lewis肺癌细胞增值的影响 

实验结果显示 ，升降二丹在一定范围内可以抑制肿瘤细胞的增长 ，见表３ 

3.4  升降二丹对小鼠 H22皮下移植性肝肿瘤组织 TNF‐α及CEA的影响 

实验结果显示 ，升降二丹能增加肿瘤组织 TNF‐α含量 ，减少肿瘤组织CEA含量 ，见图６。

4.讨论 

中药的抑瘤率大于30% ，并经统计学处理有显著性差异时 ，可继续实验 ，连续3次实验 ，疗效稳定 ， 则评价此药有一定的疗效 。本实验中 ，升降二丹能明显影响瘤质量 ，使其指数下降 （P＜0.01） ，抑瘤率为38.46％ ，显示有明显的抑瘤作用 ；升降二丹能使小鼠体表肿瘤逐渐缩小 ，延长荷瘤小鼠生存时间 ，阻止小鼠肿瘤自发转移 ，增加瘤组织TNF‐α含量 ，减少瘤组织CEA 含量 ，对小鼠体表肿瘤有明显的治疗作用 ；升降二丹能明显减少小鼠肺部结节数 ，显示对小鼠移植性肿瘤的转移具有一定的抑制作用。体外实验中 ，用不同浓度红升丹、白降丹作用于lewis 肺癌细胞 ，一定浓度范围内对lewis细胞的生长有明显的抑制作用。升降二丹是外科圣药 ，具有搜脓 、 拔毒、祛腐、生肌的功效。中医认为 ，癌是痈疽的一 种 ，治疗方法可借鉴痈疽治法。当代中医也有认为 ，癌瘤即为癌毒 ，可参考疡科古法诊治。长期以来 ，人们一直认为机体的免疫系统在肿瘤演进的过程中 能够清除肿瘤 、保护自身 ，随着研究的逐步加深越来越多的证据表明 ，肿瘤浸润的免疫细胞不但不能发挥 抗肿瘤作用 。反而会促进肿瘤生长、侵袭与转移。因此,降低因肿瘤而变大的脏器指数 ，反而更有利于增加小鼠的存活率 。这可从升降二丹对小鼠免疫器官的影响中得到验证 。本试验中脏器指数均有所下 降 ，而以脾脏指数最为明显 （P＜0.01）。这可能与升降二丹能减小因肿瘤而肿大的脾脏 、胸腺等有关。 

现代医学肿瘤的治疗仍处于综合治疗的时代 ， 在循证医学指导下的个体化的综合治疗是当今的标准治疗方案 ，多采用以手术为主的综合治疗 ，即手术、 放疗、化疗、生物治疗及分子靶向治疗等 。放疗、化疗 的毒副作用影响患者存活率 ，对晚期患者出现的并发症（ 如癌热、癌痛、骨相关事件、恶液质等） 疗效欠佳 ，治愈率不高。

中医药治疗恶性肿瘤有数千年历史 ，有确切的疗效 ，是我国肿瘤治疗的特色之一。可以提高患者生活质量 ，延长患者带瘤生存期 ，对放化疗具有增敏减毒作用 。升降二丹能使小鼠体表肿瘤逐步缩小 ，延长荷瘤小鼠生存时间 ，阻止小鼠肿瘤自发转移 ，明显抑制体表自发性肿瘤的生长。